2. Серологические реакции, используемые для диагнос­тики вирусных инфекций.

Серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др. При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов. Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды). Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

3. Возбудители малярии. Малярия – антропонозная инфекционная болезнь, вызываемая несколькими видами простейших рода Plasmodium, передающаяся комарами (Anopheles), сопровождающаяся лихорадкой, анемией, увеличением печени и селезенки. Возбудители малярии относятся к Protozoa, типу Apicomplexa, классу Sporozoa и видам Pl. vivax, Pl.malariae, Pl.falciparum, Pl.ovale.

Эпидемиология. Источник инфекции – инвазированный человек; переносчик – самка комара рода Anopheles. Основной механизм передачи – трансмиссивный, через укус инвазированной самки комара.

Лечение и профилактика. Противомалярийные препараты оказывают различное действие на бесполые, половые стадии плазмодиев. К основным противомалярийным препаратам относят хинин, хлорохин, акрихин, примахин, хиноцид, бигумаль, хлоридин и др. Профилактические мероприятия направлены на источник возбудителя (лечение больных малярией и носителей) и уничтожение переносчиков возбудителя – комаров. Разрабатываются методы вакцинации на основе антигенов, полученных методом генетической инженерии.

1.Классификация антибиотиков по химической структуре, механизму, спектру и типу действия. По хим. структ. 1класс- В-лактам – пенициллин, цефалоспорин. 2 класс- макролиды- эритромицин, азитромицин. 3 класс- аминогликозиды- стрептомицин, канамицин. 4 класс-тетрациклины-окситетрациклин, доксициклин. 5 кл- полипептиды- полимиксин. 6 кл- полиен- нистатин 7кл- анзамицин- рифампицин.

2.В зависимости от механизма дей­ствия различают пять групп антибиотиков: 1.гр антибиотики, нарушающие синтез клеточной стенки- β-лактамы. 2.гр антибиотики, нарушающие молекулярную организацию и синтез клеточных мембран - полимиксины, полиены;3.гр антибиотики, нарушающие синтез белка -аминогликозиды, тетрациклины, макроли-ды, левомицетин.4.гр антибиотики - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот - хинолоны нарушают синтез ДНК, рифампицин - синтез РНК;5.гр антибиотики, подавляющие синтез пуринов и аминокислот- сульфаниламиды.По спектру действия антибиотики пять групп в зави­симости от того, на какие микроорганизмы они оказывают воз­действие. Каж­дая из этих групп включает две подгруппы: антибиотики широ­кого и узкого спектра действия.1гр. Антибактериальные антибиотики составляют самую многочисленную группу препаратов.

а) антиби­отики широкого спектра действия оказывают влияние на представителей всех трех отделов бактерий- аминогликозиды, тетрациклины и др.

б) Антибиотики узкого спектра действия эффектив­ны в отношении небольшого круга бактерий- полет-миксины действуют на грациликутные, ванкомицин влияет на грамположительные бактерии.

2гр -противотуберкулезные, противолепрозные, противосифилитические препараты.

3.Противогрибковые антибиотики.

а) Широким спектром действия об­ладает амфотерицин В, эффективный при кандидозах, бластомикозах, аспергиллезах; в то же время

б) антибиотиком узко­го спектра действия.- нистатин, дей­ствующий на грибы рода Candida, является

4.Антипротозойные и антивирусные антибиотики на­считывают небольшое число препаратов.

5.Противоопухолевые антибиотики - препара­ты, обладающими цитотоксическим действием. Большинство из них применяют при многих видах опухолей- митомицин С. Действие антибиотиков на микроорганизмы связано с их спо­собностью подавлять те или иные биохимические реакции, про­исходящие в микробной клетке.

2. Теории иммунитета. 1.Теория иммунитета Мечникова – фагоцитоз играет решающую роль в антибактериальном иммунитете. И.И.Мечников первым рассмат­ривал воспаление как защитное, а не разрушительное явление. Ученый назвал действующие таким образом защитные клетки "пожирающими клетками". Его мо­лодые французские коллеги предложили использовать гречес­кие корни того же значения. И.И.Мечников принял этот ва­риант, и появился термин "фагоцит". 2.Теория иммунитета Эрлиха - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена. Противомикробные вещества крови Эрлих назвал "антитело". П.Эрлих осознал, что и до контакта с конкретным микробом в организ­ме уже есть антитела в виде, который он назвал "боковыми цепями"- это рецеп­торы лимфоцитов для антигенов. Потом Эрлих "применил" к фармакологии: в своей теории химиотерапии он предполагал предсуществование в организме рецеп­торов для лекарственных веществ. В 1908 г. П.Эрлиху вручили Нобелевскую премию за гуморальную теорию иммунитета. 3.Теория иммунитета Безредки - теория, объясняющая защиту организма от ряда инфекционных болезней возникновением специфической местной невосприимчивости клеток к возбудителям. 4. Инструктивные теории иммунитета - общее название теорий антителообразования, согласно которым ведущая роль в иммунном ответе отводится антигену, прямо участвующему в качестве матрицы при формировании специфической конфигурации антидетерминанты либо выступающему в качестве фактора, направленно изменяющего биосинтез иммуноглобулинов плазматическими клетками.

3.Возбудитель ботулизма. род Clostridiumвид Clostridium botulinumвызывает ботулизм - пищевую интоксикацию, характеризующуюся поражением цнс. Болезнь возникает в результате употребления пищевых продуктов, содержащих токсины С. Botulinum - грамлоложительные палочки с закругленными концами. имеет форму теннисной ракетки. Не образуют капсулу. Подвижны. Облигатные анаэробы. По антигенным свойствам которых разделяются на 7 сероваров. Ботулинический экзотоксин - самый сильный из всех биологических ядов- оказывая нейротоксическое действие (смертельная доза для человека составляет около 0,3 мкг). Микробиологическая диагностика . Выявление и идентификация ботулинического токсина в исследуемом материале с помощью реакции обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА), реакции нейтрализации токсина антитоксином (антитоксической сывороткой) на лабораторных животных. Бактериологический метод цпя обнаружения возбудителя в исследуемом материале. Специфическая профилактика. Ботулинические анатоксины А, В, Е входят в состав секстанатоксина, применяемого по показаниям. Для экстренной пассивной профилактики возможно применение противоботулинических антитоксических сывороток Лечение. Используют антитоксические противоботулинические гетерологичные сыворотки и гомологичные иммуноглобулины.

Культивирование . На кровяном агаре образует небольшие прозрачные колонии, окруженные зоной гемолиза. Резистентность. Споры С. botulinum обладают очень высокий резистентностью к высоким температурам.

Эпидемиология. Из почвы ботулиническая палочка попадает в пищевые продукты, где размножается и выделяет экзотоксин. Путь передачи инфекции – пищевой. Чаще всего фактором передачи инфекции являются консервы (грибные, овощные, мясные, рыбные). От человека человеку заболевание не передается. Патогенез. Ботулинический токсин попадает с пищей в пищеварительный тракт. Устойчивый к действию пищеварительных ферментов, токсин всасывается через стенку кишечника в кровь и обусловливает длительную токсинемию. Токсин связывается нервными клетками и блокирует передачу импульсов через нервно-мышечные синапсы. В результате развивается паралич мышц гортани, глотки, дыхательных мышц, что приводит к нарушению глотания и дыхания, наблюдаются изменения со стороны органов зрения. Клиническая картина. Инкубационный период продолжается от 6-24 ч до 2-6 дней. Чем короче инкубационный период, тем тяжелее протекает болезнь. Обычно заболевание начинается остро, но температура тела при этом остается нормальной. Возможны различные варианты ботулизма – с преобладанием симптомов поражения пищеварительного тракта, расстройств зрения или дыхательной функции. В первом случае заболевание начинается с появления сухости во рту, тошноты, рвоты, поноса. Во втором – первые проявления болезни связаны с нарушениями зрения (больной жалуется на «туман» перед глазами и двоение). В результате паралича мышц гортани появляется осиплость, а затем голос пропадает. Больные могут погибнуть от паралича дыхания. Заболевание может осложниться острой пневмонией, токсическим миокардитом, сепсисом. Летальность при ботулизме составляет 15-30%. Иммунитет. не формируется. Антитела, которые вырабатываются в течение заболевания, направлены против определенного серовара.

1.Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. 1)Метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемый микроб, а затем вносят антибиотики. препараты вносят или в специальные лунки в агаре, или на поверхности посева раскла­дывают диски с антибиотиками («метод дис­ков»). Учет результатов проводят через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков). 2)Методы определения. минимального уровня антибиотика, кото­рый позволяет in vitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или пол­ностью ее стерилизует. А)Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом дисков. Исследуемую бактериальную культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.Б)Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный. В)На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинако­вом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Г)Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методом серийных разведений. определяют минимальную концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры бактерий.

Д)Оценку результатов определения чувствительности микро­организмов к антибиотикам проводят по специальной готовой таблице, которая содержит пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных штам­мов, а также значения МИК антибиотиков для устойчивых и чувствительных штаммов. 3)Определение антибиотика в крови, моче и других жидкостях организма человека. В штатив устанавливают два ряда проби­рок. В одном из них готовят разведения эталонного антибиотика, в другом - исследуемой жидкости. Затем в каждую пробирку вносят взвесь тест-бактерий, приготовленную в среде Гисса с глюкозой. При определении в исследуемой жидкости пеницил­лина, тетрациклинов, эритромицина в качестве тест-бактерий используют стандартный штамм S. aureus, а при определении стрептомицина - Е. coli. После инкубирования посевов при 37 °С в течение 18-20 ч отмечают результаты опыта по помутнению среды и ее окрашиванию индикатором вследствие расщепления глюкозы тест-бактериями. Концентрация антибиотика опреде­ляется умножением наибольшего разведения исследуемой жид­кости, задерживающей рост тест-бактерий, на минимальную концентрацию эталонного антибиотика, задерживающего рост тех же тест-бактерий. Например, если максимальное разведение исследуемой жидкости, задерживающее рост тест-бактерий, рав­но 1:1024, а минимальная концентрация эталонного антибио­тика, задерживающего рост тех же тест-бактерий, 0,313 мкг/мл, то произведение 1024- 0,313=320 мкг/мл составляет концен­трацию антибиотика в 1 мл.

4)Определение способности S. aureus продуцировать бета-лактамазу. В колбу с 0,5 мл суточной бульонной культуры стандарт­ного штамма стафилококка, чувствительного к пенициллину, вносят 20 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питатель­ного агара, перемешивают и выливают в чашку Петри. После застывания агара в центр чашки на поверхность среды поме­щают диск, содержащий пенициллин. По радиусам диска петлей засевают исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня, после чего отмечают результаты опыта. О способности исследуемых бактерий продуцировать бета-лакта-мазу судят по наличию роста стандартного штамма стафило­кокка вокруг той или другой исследуемой культуры (вокруг диска).

2.Расстройства иммунной системы: первичные и вторичные иммунодефициты. Иммунодефициты - это нарушения нор­мального иммунного статуса, обусловлен­ные дефектом одного или нескольких механизмов иммунного ответа.Первичные, или врожденные иммунодефициты.Расстройства иммунной системы могут затра­гивать как основные специфические звенья в функционировании иммунной системы, так и факторы, определяющие неспецифическую резистентность. Возможны комбинирован­ные и селективные варианты иммунных рас­стройств. В зависимости от уровня и характера нарушений различают гуморальные, клеточ­ные и комбинированные иммунодефициты.

Причины : удвоение хромосом, точечные мутации, дефект фер­ментов обмена нуклеиновых кислот, генети­чески обусловленные нарушения мембран, повреждения генома в эмбриональном пе­риоде и др. Первичные имму­нодефицита проявляются на ранних этапах постнатального периода и наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Проявления – недостаточность фагоцитоза, системы комп­лемента, гуморального иммунитета (В-системы), клеточного иммунитета (Т-системы). Вторичные, или приобретенные, иммунодефициты Вторичные иммунодефициты в отличие от первичных развиваются у лиц с нормально функционировавшей от рождения иммунной системой. Они формируются под воздействи­ем окружающей среды на уровне фенотипа и обусловлены нарушением функции иммунной системы в результате различных заболеваний или неблагоприятных воздействий на орга­низм. Поражаться Т- и В-системы иммунитета, фак­торы неспецифической резистентности, воз­можны также их сочетания. Вторичные имму­нодефицита встречаются значительно чаще, чем первичные. Вторичные иммунодефициты поддаются иммунокоррекции,

Вторичные иммунодефицита могут быть:

после перенесенных инфекций (особенно ви­русных) и инвазий (протозойные и гельминтозы);

при ожоговой болезни;

при уремии; при опухолях;

при нарушении обмена веществ и истощении;

при дисбиозах;

при тяжелых травмах, обширных хирургических операци­ях, особенно выполняемых под общим нар­козом; при облучении, действии химических веществ;

при старении,

медикамен­тозные, связанные с приемом лекарств.

По клиническому течению выделяют: 1)компенсированную, - повышенной восприимчивостью организма к инфекционным агентам. 2)субкомпенсированную- хронизация инфекционных процессов.

3)декомпенсированную - генерализованных инфекций, вызванных условно-патогенными микробами (УПМ) и злокачественными новообразова­ниями.

3. Возбудитель амебиаза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическое лечение. Амебиаз – инфекционная болезнь, вызываемая Entamoeba histolytica, сопровождающаяся язвенным поражением толстой кишки; возможно образование абсцессов в различных органах; протекает хронически. Protozoa, типу Sarcomastidophora, подтипу Sarcodina.

Морфология и культивирование. Возбудитель существует в двух стадиях развития: вегетативной и цистной. Вегетативная стадия имеет несколько форм (тканевая, большая вегетативная, просвет-ная и предцистная). Циста (покоящаяся стадия) имеет овальную форму, образуется из вегетативных форм в кишечнике. Инфицирование происходит при попадании цист возбудителя в кишечник, где из них образуются кишечные вегетативные формы.

Резистентность . Вне организма быстро (через 30 мин) погибают тканевая и просветная формы возбудителя. Цисты устойчивы в окружающей среде, сохраняясь в фекалиях и воде при температуре 20ºС в течение месяца. В продуктах питания, на овощах и фруктах цисты сохраняются в течение нескольких дней.

Механизм передачи – фекаль-но-оральный. Заражение происходит при занесении цист с продуктами питания, особенно овощами и фруктами, реже – с водой, через предметы домашнего обихода. Распространению цист способствуют мухи и тараканы.

Патогенез и клиническая картина. Цисты, попавшие в кишечник, и образовавшиеся просветнью формы амеб могут обитать в нем, не вызывая заболевания. При снижении резистентности организма амебы внедряются в стенку кишечника и размножаются. Развивается кишечный амебиаз. Этому процессу способствуют некоторые представители микрофлоры кишечника. Поражаются с образованием язв верхний отдел толстой кишки, иногда – прямая кишка. Отмечается частый жидкий стул. В испражнениях обнаруживают гнойные элементы и слизь. Может происходить перфорация кишечной стенки с развитием гнойного перитонита. Амебы с током крови могут попадать в печень, легкие, головной мозг – развивается внекишечный амебиаз. Возможно появление кожного амебиаза, развивающегося как результат вторичного процесса. На коже перианальной области, промежности и ягодиц образуются эрозии и малоболезненные язвы. Иммунитет. При амебиазе иммунитет нестойкий. Лечение и профилактика . В лечении используются следующие препараты: действующие на амеб, находящихся в просвете кишечника (производные оксихинолина – хиниофон, энтеросептол, мексаформ, интестопан, а также соединения мышьяка – аминарсон, осарсол и др.); действующие на тканевые формы амеб (препараты эметина); действующие на просветные формы амеб и амеб, находящихся в стенке кишки (тетрациклины); действующие на амеб при любой их локализации (производные имидазола – метронидазол). Профилактика амебиаза связана с выявлением и лечением цистовыделителей и носителей амеб.

Микробиологическая диагностика. Основной метод - микроскопическое исследование испражнений больного, а также содержимого абсцессов внутренних органов. Мазки окрашивают раствором Люголв или гематоксилином с целью идентификации цист и трофозоитов. Серологический метод: РИГА, ИФА, РСК и др. Наиболее высокий титр антител выявляют при внекишечном амебиазе.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы , т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

Иммунодефициты, как первичные, так и особенно вторичные , широко распростране­ны среди людей. Они являются причиной проявления многих болезней и патологичес­ких состояний, поэтому требуют профилак­тики и лечения с помощью иммунотропных препаратов.

34. Инактивированные (корпускулярные) вакцины. Получение. Применение. Достоинства. Недостатки.

Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий, (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе протективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины).

Для выделения из бактерий и вирусов антигенных комплексов (гликопротеинов, ЛПС, белков) применяют трихлоруксусную кислоту, фенол, ферменты, изоэлектрическое осаждение.

Их получают путем выращивания патогенных бактерий и вирусов на искусственных питательных средах, инактивируют, выделяют антигенные комплексы, очищают, конструируют в виде жидкого или лиофильного препарата.

Преимуществом данного типа вакцин является относительная простота получения (не требуется длительного изучения и выделения штаммов). К недостаткам же относятся низкая иммуногенность, потребность в трехкратном применении и высокая реактогенность формализированных вакцин. Так же, по сравнению с живыми вакцинами, иммунитет, вызываемый ими, непродолжителен.

В настоящее время применяются следующие убитые вакцины: брюшнотифозная, обогащенная Vi антигеном; холерная вакцина, коклюшная вакцина.

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики . Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации

РТГА применяют для идентификации вирусов , способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов

Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.

Прямая иммунофлюоресценция

Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклона л ьных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют способность лимфоцитов отвечать на различные АГ и митогены.

В работе практических лабораторий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли методы идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT.

Торможение гемагглютинации РТГА применяют для идентификации вирусов, способных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов Реакцию торможения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применѐнным AT.

Прямая иммунофлюоресценция.

Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 недели, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать несвязавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (позволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.

Выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке крови. РТГА. РСК. РИФ.

Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител.

Более простой и доступный подход - выявление противовирусных антител (AT) в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2~3 недели. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествующей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы указывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT, выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать антитела (AT), образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабельна для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую - в период выздоровления (через 2-3 недели). Полученные результаты носят ретроспективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований. РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вируса гриппа).

Метод позволяет легко выявлять подобные антитела (AT) в сыворотке больного. РСК - основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция выявляет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции.

Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их последующее удаление и люминесцентную микроскопию образца. Иммуносорбционные методы выявления противовирусных антител Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, поскольку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динамике инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный АГ сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соответствующей инкубации несвязавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к Ig человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наибольшее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

Выявление вирусных антигенов (АГ). ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления АГ некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления АГ на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую АГ; после инкубирования несвязанный АГ декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы. Гибридизация ДНК - высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы.

Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ. Для постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпштейна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.