В настоящее время широко применяются серологические реакции (СР), в которых участвуют меченые АГ или АТ. К ним относятся реакция иммунофлюоресценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы, реакция иммуноблотинга, проточная цитометрия и электронная микроскопия.
Они применяются:
1) для серодиагностики инфекционных заболеваний, т. е. для выявления АТ с помощью набора известных конъюгированных (химически соединённых) с различными метками (ферментами, флюорохромными красителями), антигенов;
2) для определения микроорганизма или его серовара с помощью стандартных меченных диагностических антител (экспресс-диагностика).
Готовят диагностические сыворотки иммунизацией животных соответствующим АГ, затем выделяют иммуноглобулины и конъюгируют их со светящимися красителями (флюорохромами), ферментами, радиоизотопами.
Диагностических моноклональных антител получают с помощью гибридных клеток, образованных путем слияния иммунного В-лимфоцита с миеломной клеткой. Гибридомы способны быстро размножаться in vitro в культуре клеток и продуцировать при этом иммуноглобулин, характерный для взятого В-лимфоцита.
Меченые СР по специфичности не уступают другим СР, а по своей чувствительности они превосходят все СР.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
В качестве метки используются светящиеся флюорохромные красители (изотиоционат флюоресцеина и др.).
Существуют различные модификации РИФ. Для экспресс – диагностики инфекционных заболеваний - для выявления микробов или их антигенов в исследуемом материале применяется РИФ по Кунсу.
Выделяют два метода РИФ по Кунсу: прямой и непрямой.
Компоненты прямой РИФ:
1) исследуемый материал (испражнение, отделяемое носоглотки и др.);
2) меченая специфическая иммунная сыворотка, содержащая АТ к искомому антигену;
3) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала обрабатывают меченой антисывороткой.
Происходит реакция АГ-АТ. При люминесцентном микроскопическом исследовании в том участке, где локализуются комплексы АГ-АТ, обнаруживают флюоресценцию метки (рис.34).
Компоненты непрямой РИФ, предназначенной для экспреесс-диагностики гриппа А:
1) исследуемый материал смыв с носоглотки больного с подозрением на грипп;
2) специфическая антисыворотка с антителами против вируса гриппа А;
3) антиглобулиновая сыворотка (АТ против иммуноглобулина), меченная флюорохромом;
4) изотонический раствор хлорида натрия.
Мазок из исследуемого материала сначала обрабатывают иммунной сывороткой к искомому антигену, а затем – меченной антиглобулиновой сывороткой.
Иммунные комплексы АГ-АТ – меченные АТ обнаруживаются при помощи люминесцентного микроскопа.
Преимущество непрямого метода состоит в том, что нет необходимости приготовления широкого набора флюоресцирующих специфических сывороток, а применяется лишь одна флюоресцирующая антиглобулиновая сыворотка.
Для серологической диагностики гриппа А, то есть для определения антител против вируса гриппа А в сыворотке крови с помощью непрямой РИФ используют гриппозный диагностикум (антиген вируса гриппа А). Серодиагностика вирусных инфекций в основном носит ретроспективный характер и применяется для подтверждения диагноза и эпидемиологического анализа.
Иммуноферментный анализ (ИФА): конкуретный способ (определение HBs-АГ вируса гепатита В) и непрямой способ (серологическая диагностика ВИЧ - инфекции)
Иммуноферментный анализ (ИФА)
В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.
Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина (ОФД) или тетраметилбензидин (ТМБ).
Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (рис.35), непрямой и конкурентные способы (рис.36).
Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре (ИФА – анализаторе).
К преимуществам ИФА следует отнести:
Простота методов оценки реакции;
Стабильность конъюгатов;
Легко поддаётся автоматизации.
В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:
А) конкурентный тип
Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определения носительства HBs Ag.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;
2) антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;
3) конъюгат – мышиные моноклональные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой;
4) ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат;
5) фосфатно – солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
Положительная (сыворотка с HBs Ag);
Отрицательная (сыворотка без HBs Ag).
Ход работы:
2. Инкубация 1 час при 37°С.
3. Отмывание лунок.
4. Внесение конъюгата.
5. Инкубация 1 час при 37°С.
6. Отмывание лунок.
7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.
8. Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.
Реакция протекает в три фазы:
1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ-АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).
2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ - HBs Ag - anti HBs АТ, меченые пероксидазой).
3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.
В) непрямой тип
Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.
Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.
Компоненты:
1) исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ);
2) синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки;
3) антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ);
5) фосфатно-солевой буфер;
6) контрольные сыворотки:
Положительная;
Отрицательная.
Ход работы:
1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.
2. Инкубация 30 минут при 37°С.
3. Отмывание.
4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом.
5. Инкубация 30 минут при 37°С.
6. Отмывание.
7. Внесение ОФД.
Реакция протекает в 3 фазы:
1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ (АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ).
2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки.
3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.
Лабораторная диагностика использует сразу несколько тестов на сифилис для получения максимально точного результата. Это занимает больше времени, но зато даёт наиболее точный ответ.
Чаще всего результат анализа РИФ представляют цифрами. Расшифровка имеет следующие обозначения:
- резко положительный результат обозначается 4 плюсами (++++);
- положительный результат обозначается 3 плюсами (+++);
- слабоположительный результат 2 плюсами (++);
- сомнительный результат 1 плюс (+);
- отрицательный результат обозначается 1 минусом (-).
Результат РИФ на сифилис также представляется в процентном варианте, который зависит от количественного показателя связанных бактерий:
- при отрицательном результате иммобилизация до 20%;
- при слабоположительном результате иммобилизация варьирует от 20 до 50%;
- при положительном результате иммобилизация выше 50%.
Если результат выдал положительный ответ, то это констатирует наличие заболевания.
Если результат слабоположительный , то это указывает на единичное количество остаточных антител в крови.
Отрицательный результат говорит об отсутствии бледной трепонемы, а это означает, что пациент здоров.
Опытные врачи нашей клиники проведут диагностику сифилиса быстро и с высокой точностью показаний. Мы социально ориентированы на все слои населения, поэтому стоимость анализа РИФ недорогая . Цена представлена в таблице на нашем сайте.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса) является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. РИФ основана на использовании флюоресцеинизотиоцианата ¾ ФИТЦ или других флюорохромов, химически связанных, конъюгированных с АТ. При этом меченые АТ сохраняют иммунологическую специфичность и вступают во взаимодействие со строго определенными корпускулярными АГ.
Различают две основные разновидности метода: прямой и непрямой.
Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого или желтого цвета.
Непрямой метод РНИФ заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из исследуемых микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.
Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты
Твердофазный ИФА является наиболее распространенным вариантом ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропланшетов из полистирола (рис. 27). При определении антител в лунки микропланшетов с сорбированными антигенами последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, субстрат для фермента (Н 2 О 2 или фосфатид) и хромоген (индикатор, окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента и хромоген.
Рис. 27. Принцип постановки ИФА для обнаружения антимикробных антител
Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)
Радиоиммунологический анализ (РИА) ¾высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопами (l25 J, 14 С, 3 Н, 51 Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. При твердофазном варианте РИАодин из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. При другом варианте метода ¾ конкурентном РИА ¾искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИАприменяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концентрациях ¾ 10 -10 -10 -12 г/л.
Открытая еще в 1942 году Кунсом, реакция иммунофлуоресценции не является новым методом исследования. Однако появление гибридомных технологий, которые позволили получить моноклональные антитела, дало «вторую жизнь» этой реакции, поскольку их использование позволило в несколько раз увеличить чувствительность данной реакции и ее специфичность.
И сегодня мы расскажем вам в подробностях про реакцию прямой и непрямой иммунофлуоресценции (РИФ) как метод диагностики Кунса для взрослых мужчин и женщин при беременности.
Что такое реакция иммунофлуоресценции
Представляя собой отличную возможность для быстрого получения точного диагноза, реакция иммунофлуоресценции позволяет определить наличие возбудителя заболевания в патологическом материале. Для этого применяется мазок из материала, который специальным образом обрабатывается с помощью меченого ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианатом), и изучается в качестве гетерогенного анализа.
Для получения результата применяется люминесцентного микроскопа, в его оптической системе находится набор светофильтров для обеспечения препарата сине-фиолетовым либо ультрафиолетовым светом, имеющий заданную длину волны. Данное условие позволяет флюорохром отсвечивать при заданном диапазоне. Исследователем оцениваются свойства свечения, его характер, размеры объектов и их взаиморасположение.
Кому ее назначают
Проведение реакции иммунофлуоресценции может назначаться при диагностике множества вирусных заболеваний. В частности, ее назначают при комплексном обследовании на выявление следующих факторов:
- наличие в организме вируса ;
- заражение сальмонеллой;
- существование в организме определенных антигенов;
- выявляется вероятность заражения организма хламидиями, микоплазмами и другими микроорганизмами, имеющими способность к возбуждения вирусных заболеваний человека;
- диагностика вирусных болезней у животных.
Перечисленные показания позволяют использовать реакцию иммунофлуоресценции при выявлении в организме человека и животных вирусных заболевания различной природы.
Цели проведения
Поскольку данный метод диагностики имеет множество преимуществ, к которым следует отнести его высокую результативность, быстроту проведения и получения результата, а также отсутствие большого количества противопоказаний, с его помощью определяется наличие в организм вирусных инфекций. Поэтому назначать данный анализ могут как для постановки, так и для уточнения диагноза, на основании которого назначается схема лечения.
Проведение процедуры не вызывает неприятных ощущений, для нее необходимо получить материал для анализа, который берется из любой жидкости организма: слюны, мокроты, соскоб с поверхности слизистых оболочек. Также может для проведения анализа браться кровь. Частоту проведения реакции иммунофлуорсценции назначает лечащий врач, которому необходимо получить данные по динамике протекающих в организме процессов.
Поскольку вреда как для организма, так и для общего самочувствия человека данный анализ не несет, назначаться он может по необходимости.
Виды такой процедуры
Сегодня применяется несколько разновидностей данного анализа, каждый из которых имеет ряд специфических особенностей и позволяет получить максимально развернутую картину процессов, происходящих в организме.
К разновидностям реакции иммунофлуоресценции следует отнести:
- — один из наиболее бурно развивающихся видов диагностики, этот анализ дает возможность получения количественных данных без применения серийных разведений. Благодаря использованию полученных измерений оптической плотности жидкости получается точно определить уровень концентрации нужного компонента. Широкие возможности данного вида анализа используются при использовании для его осуществления моноклональных антител, что позволяет определить фазу инфекционного процесса, его остроту;
- ДНК-диагностика — данный метод основан на комплементарном связывании нуклеотидов, для чего могут использоваться такие жидкости, как слюна, кровь, ликвор, моча, мокрота, биоптаты, кровь. Данный метод наиболее эффективно позволяет выявить наличие в организме вирусов папилломы, однако многие современные тест-системы могут изредка давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Причиной их может быть загрязнения проб жидкости для проведения анализа специфической ДНК, наличие которой может иметь гнездный или тотальный характер;
- иммунохромотография — специфика этого способа определения наличия в организме патологической среды и вирусов состоит в применении в ходе реакции меченых антител. Используется данный метод диагностики для выявления и степени активности процесса заражения стрептококками группы А, а также хламидиями следующих видов: Clamikit R Innotech International, Clearview TM Chlamydia фирмы Oxoid. Обладая максимально высокой чувствительностью, тест-системы, которые основаны на данной методике исследования. применяются обычно как ориентировочный тест.
Перечисленные разновидности имеют особенности проведения и специфические характеристики результатов, однако все они направлены на получение данных о наличии в организме патологических микроорганизмов и вирусов, а также о степени их размножения и активности.
Показания к проведению
Реакция иммунофлуоресценции может назначаться для выявления в организме любого вида патологической среды.
Хламидии, трихомонады, гонококки и , а также лямблии всех видов определяются при проведении данного вида диагностики. и , и другие болезни также требуют проведения РИФ. Назначение врача для ее осуществления обязательно.
Противопоказания для проведения
Поскольку для проведения данной реакции в качестве исследуемого материала требуется любой вид жидкости организма, взятие их обычно не составляет трудностей и противопоказаний для осуществления реакции иммунофлуоресценции не существует. Однако при беременности и у детей до 6 месяцев взятие материала для исследования проводится с максимальными предосторожностями.
Отсутствие противопоказаний позволяет осуществлять проведение данного вида диагностики при назначении врача всем пациентам. Безопасность ее гарантируется использованием дезинфицированным инструментом и одноразовыми шприцами.
Подготовка к процедуре
Особенностей взятия материала для проведения данного анализа не существует. Кровь для него берется натощак, чтобы не было повышенного содержания в ней веществ, которые может изменить истинные показания и дать ложную картину.
Как проходит забор анализов
Поскольку особой подготовки для проведения анализа не требуется, исключается только прием пищи за 12 часов до ее проведения и отсутствие применения лекарственных препаратов, выполняется взятие исследуемого материала как обычный процесс взятия жидкости организма на анализ.
Субъективные ощущения во время процедуры могут различаться в зависимости от чувствительности.
Расшифровка результатов
Применение современных тест-систем позволяет получать максимально точные результаты анализа. Для расшифровки результата применяются следующие данные:
- степень интенсивности флюоресценции;
- оттенок флюоресценции;
- периферический характер процесса свечения объекта;
- характеристики морфологии, расположения возбудителя во взятом мазке исследуемого материала и его размеры.
Во время исследования объектов, имеющих крупные размеры (например, гарденереллы, трихомонады, клетки, которые уже поражены вирусами), перечисленные выше критерии дают возможность получения максимально достоверных результатов. Однако элементарные тела микоплазмы и хламидий обладают размерами, лежащими на пределе разрешающих способностей люминесцентного микроскопа, что затруд
няет получение точного результата, поскольку периферическое свечение теряет часть своей интенсивности. Оставшиеся критерии уже недостаточны для точной идентификации исследуемых микроорганизмов. По этой причине особые требования предъявляются к специалистам, которые проводят данный вид исследования: уровень их квалификации должен быть достаточным для оперирования имеющимися данными.
По этой причине расшифровкой полученного анализа может заниматься только врач с соответствующим уровнем квалификации. Про цену на исследование методом РИФ читайте ниже.
Средняя стоимость
Цена проведения реакции иммунофлуоресценции зависит от места ее проведения и уровня медицинского учреждения,а также квалификации проводящего анализ специалиста. Сегодня стоимость колеблется от 1280 до 2 160 рублей.
Более подробно о иммунологических реакциях поведает видео ниже:
Реакция основана на том, что иммунные сыворотки обрабатывают флюорохромами (ФИТЦ), которые соединяются с антителами. Сыворотки при этом не теряют своей иммунной специфичности. При взаимодействии полученной люминесцентной сыворотки с соответствующим антигеном образуется специфический светящийся комплекс, легко видимый в люминесцентном микроскопе.
Различные иммунофлюоресцентные сыворотки могут быть использованы для прямого и непрямого метода иммунофлюоресценции. При прямом методе специфические флюоресцирующие иммунные сыворотки готовят для каждого микроба путем иммунизации кролика убитой культурой возбудителя, затем иммунную сыворотку кролика соединяют с флюорохромом (изоционат или изо-тиоционат флюоресцеина). Метод применяется для экспресс-диагностики с целью обнаружения бактериальных или вирусных антигенов.
Непрямой метод предусматривает использование диагностической иммунной не флюоресцирующей сыворотки (иммунизированного кролика или больного человека) и флюоресцирующей сыворотки, имеющей антитела против видовых глобулинов диагностической сыворотки.
Работа № 3
Иммуноферментный анализ (ифа)
Широкое применение находит твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Он основан на том, что белки прочно адсорбируются на пластинках, например из поливинилхлорида. Один из наиболее распространенных на практике вариантов ИФА основан на использовании меченных ферментом специфических антител той же специфичности. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор с анализируемым антигеном. В процессе инкубации на твердой фазе образуются специфические комплексы антиген-антитело. Затем носитель отмывают от не связавшихся компонентов и добавляют гомологичные антитела, меченные ферментом, которые связываются со свободными валентностями антигена в составе комплексов. После вторичной инкубации и удаления избытка этих меченных ферментом антител определяют ферментативную активность на носителе, величина которой будет пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.
При другом варианте ИФА к иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку. После инкубации и удаления не связавшихся компонентов с помощью меченных ферментом антиглобулиновых антител выявляют специфические иммунокомплексы. Данная схема является одной из наиболее распространенных при постановке ИФА.
Специфические Исследуемый материал- Специфические антитела Субстрат
антитела возбудитель с пероксидазой для пероксидазы
Исследуемая АГС, меченая
сыворотка пероксидазой Субстрат для
Специфический пероксидазы
Контроль:
позитивный - иммунная сыворотка, меченная пероксидазой + субстрат - 2 лунки;
негативный - нормальная сыворотка + субстрат - 2 лунки.